科研进展

南海海洋所揭示抗肿瘤非典型角环素二聚体形成机制

  

  近日,中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室的研究人员揭示了非典型角环素类海洋天然产物二聚体形成的关键机制。2018年5月25日,该研究成果以“Molecular basis of dimer formation during the biosynthesis of benzofluorene-containing atypical angucyclines”为题发表于Nature Communications(DOI: 10.1038/s4146704487-z)。

  含有苯并芴(benzofluorene)结构的非典型角环素类化合物在自然界中分布广泛,骨架类型丰富多样,生物活性优良,是开发抗肿瘤药物和酶抑制剂的热点分子,包括fluostatins(FSTs)及lomaiviticins等代表性化合物(图1A),受到国内外生物学家、药物化学家及药理学家的广泛关注。海洋微生物生产的具有独特C2对称结构的同源二聚体lomaiviticin A和具有C1?C5′非对称结构的异源二聚体difluostatin A具有强烈的抗肿瘤和抗菌活性。其中,lomaiviticin A是极强的DNA损伤剂,能够通过破坏DNA的方式杀灭癌细胞,目前正作为低剂量化疗药物进行临床前评估。据报道,二聚化能显著增强这些化合物的生物活性。因此,研究二聚化机制,对于非典型角环素类化合物的结构多样化及构效关系研究至关重要。已有的研究表明,天然产物二聚体一般可由细胞色素P450氧化酶催化形成。但大多数情况下,二聚体形成机制仍是未解之谜。

  前期工作中,研究人员从南海北部冷泉区沉积环境来源的稀有放线菌Micromonospora rosaria SCSIO N160的培养物中分离鉴定了非典型角环素类化合物FSTs(Journal of Natural Products, 2012, 75, 1937-1943;Organic Letters, 2017, 19, 592–595);克隆了完整的FST生物合成基因簇(fls),在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor YF11中成功异源表达,获得了结构独特的二聚体化合物difluostatin A(Organic Letters, 2015, 17, 5324-5327,)。研究人员将fls生物合成基因簇在白色链霉菌Streptomyces albus J1074中进行了异源表达,又获得一系列结构新颖的C?C或C?N偶联的FST二聚体(difluostatins B–D)甚至三聚体trifluostatin A(图1B)。

图1. 代表性非典型角环素类化合物(A)和fluostatin生物合成基因簇及其在S. albus J1074中异源表达的代表性产物(B)。

  非典型角环素家族中,这些结构复杂的C?C或C?N偶联的二聚或三聚FSTs到底是如何形成的?据文献报道推测,该类二聚体可能是由NmrA家族调控蛋白酶FlsQ1催化形成。研究人员随后构建了flsQ1缺失突变株,但发现该突变株仍能生产difluostatin A。意外的是,研究人员经过反复多次观测发现,含有酰基的FSTs(acyl FSTs)可以在水溶液中经非酶催化的脱酰基反应自发形成C?C偶联的FST二聚体,如difluostatin F (图2A)。进一步深入研究发现:(1)acyl FSTs在非质子有机溶剂(如二甲基亚砜、丙酮和氯仿等)中表现稳定;(2)acyl FSTs在酸性条件下也表现稳定,但在碱性条件下很容易脱酰形成二聚体;(3)acyl FSTs在H218O中所形成的脱酰基产物和二聚体产物都标记上了18O。据此,研究人员推测了acyl FSTs自发脱酰和二聚化的两步反应机制(图2A):第一步反应是acyl FSTs通过非酶催化脱酰氧基形成一个对醌酮甲基化物(para-quinone methide, p-QM)中间体;第二步反应是该p-QM中间体通过和水进行1,6-亲核加成反应形成“脱酰基”产物,或者通过与另一分子的FST进行亲核加成反应形成结构多样化的C?C或C?N偶联的同源或异源FSTs类二聚体。

 

图2. FlsH酶催化脱酰机理和非酶催化脱酰-二聚体形成机制(A)及其在合成C?C或C?N偶联的FST二聚体中的应用(B)

  为了证明该二聚体形成机制的合理性,研究人员通过化学半合成法,在水溶液中共培养acyl FST和prefluostatin,高效获得了difluostatin A(图2B)。进而,研究人员利用acyl FSTs能够形成p-QM中间体的这种不同寻常的特性,通过化学半合成法制备了多种C?C或C?N偶联的芳香聚酮二聚体(图2B)。有意思的是,研究人员还发现水解酶FlsH能够有效地催化acyl FSTs的脱酰反应(图2A)。与自发脱酰相比,FlsH催化的脱酰反应速率提高了近230倍。经推测,FST生物合成途径中进化出脱酰酶FlsH,可能是为了阻止acyl FSTs在体内的高浓度积累,以防其自发转化为具有体内细胞毒性的p-QM中间体。

  以上研究结果启示,许多从自然界中获得二聚体化合物或是由非酶催化形成的“非天然”产物。此外,该研究工作也暗示需要重新思考一下关于lomaiviticin A的二聚体形成的假设:酶催化的C–C偶联反应还是非酶催化的自发反应?揭开这些复杂反应的神秘面纱,对于高效生产lomaiviticin A及创制新型非典型角环素二聚体类药物先导化合物具有重大意义。

  中国科学院南海海洋研究所黄春帅博士研究生和杨春芳助理研究员为该论文的共同第一作者,张长生研究员和美国德克萨斯大学奥斯汀分校的Hung-wen Liu教授为论文的共同通讯作者。研究工作获得了中国科学院、国家自然科学基金、广东省科技计划等项目的资助。论文作者之一Bidhan Chandra De博士生是CAS-TWAS院长奖学金获得者。

  相关论文:

  1. Huang C,# Yang C,# Zhang W, Zhang L, De BC, Zhu Y, Jiang X, Fang C, Zhang Q, Yuan CS, Liu Hw*, and Zhang C*. Molecular basis of dimer formation during the biosynthesis of benzofluorene-containing atypical angucyclines. Nature Communications, 2018, 4487. DOI: 10.1038/s4146704487-z.

  2. Zhang W#, Yang C#, Huang C, Zhang L, Zhang H, Zhang Q, Zhu Y, Zhang C*. Pyrazolofluostatins A-C, pyrazole-fused benzo[a]fluorenes from South China Sea-derived Micromonospora rosaria SCSIO N160. Organic Letters, 2017, 19 (3): 592–595. DOI: 10.1021/acs.orglett.6b03745. ("Hot off the press" in Natural Product Reports, 2017, 34 (4) : 338-342).

  3. Yang C, Huang C, Zhang W*, Zhu Y, Zhang C*. Heterologous expression of fluostatin gene cluster leads to a bioactive heterodimer. Organic Letters, 2015, 17(21): 5324-5327. DOI: 10.1021/acs.orglett.5b02683r. ("Hot off the press" in Natural Product Reports, 2016,33(2): 122-126).

  4. Zhang W#, Liu Z#, Li S, Lu Y, Chen Y, Zhang H, Zhang G, Zhu Y, Zhang G, Zhang W, Liu J, Zhang C*. Fluostatins I–K from the South China Sea-Derived Micromonospora rosaria SCSIO N160. Journal of Natural Products, 2012, 75(11): 1937–1943. DOI: 10.1021/np300505y.